دوستان عزیز این هفته می خوام تکنیکی رو براتون بگم که میشه گفت با اومدنش علم مولکولی رو دگرگون کرد این تکنیک چیزی نیست جز، PCR که روشی غیر از کلون سازیه که مقادیر نامحدودی از یک توالی موردنظر را تولید می کنه در واقع با این روش میشه طی چند ساعت بیلیون ها نسخه از توالی اولیه به وجود آورد .
این تکنیک برای بررسی حضور یا عدم حضور یک ژن خاص در مخلوطی از DNA ها، تشخیص های قبل از تولد (تعیین جنسیت ، بیماری ها ) و ... که حالا هفته های بعد براتون خیلی کامل تر میگم کاربرداشو، استفاده میشه.
تکنیک PCR همون همانندسازی در شرایط in vitro هست در واقع یعنی تکثیرآنزیمی یک قطعه ازDNA که بین دو الیگونوکلئوتید (پرایمرها) قرار گرفته بنابراین باید با به کارگیری علم بیوانفورماتیک توالی اطراف قطعه مورد نظرمون را پیدا کنیم و با طراحی پرایمر براشون و اعمال سیکل های مکرر حرارتی اون قطعه رو تکثیر کنیم.
حالا که تا حدودی فهمیدیم اصلا PCR چیه وقتش رسیده که ببینیم که مراحلش چیه و چجوری باید انجامش بدیم.
خب بعد از استخراج DNA که هفته های پیش براتون گفته شد، یه سری مواد و وسایل برای PCR لازم داریم مثل : بافر ، آنزیم،MgCl2 ، dNTP ، پرایمر، آنزیم DNA پلیمراز Taq یا Pfu مقاوم به حرارت و .. و DNA الگو که همه ی این مواد و در تیوب مخصوص ریخته و در دستگاه ترکوسایکلر که سیکل های مکرر حرارتی اعمال می کنه قرار میدیم
مراحل یک سیکل PCR عبارت است از :
مرحله واسرشتDenaturation) ) : مرحله باز شدن دو رشته DNA ، که در این مرحله دمای دستگاه را معمولا تا دمای 94 تا 98 درجه سانتیگراد بالا برده که این دما باعث گسستن پیوند های هیدروژنی دو رشته DNA و نهایتا دناتوره شدن مولکول می شه. حرارت در این مرحله به میزان نوکلئوتیدها در DNA بستگی داره.
مرحله اتصال (Annealing) : در این مرحله حرارت تا دمای 55-65 درجه سانتیگراد پایین میآید ، در این مرحله پرایمرهای موجود در مخلوط واکنش در محل های ویژه ای از مولکول DNA اتصال پیدا میکنن. البته در این دما امکان دو رشته ای شدن مجدد DNA وجود دارد ولی عمدتا این اتفاق رخ نمی ده.
مرحله پليمريزاسيون یا طویل شدن (Extension/elongation step): در مرحله سوم دوباره دمای دستگاه تا 72 درجه سانتیگراد افزایش پیدا میکنه که این دما مناسب ترین حرارت برای عملکرد صحیح آنزیم DNA پلیمراز Taq موجود در مخلوط واکنش هست. در اینجا وظیفه آنزیم پلیمراز اینه که به هر پرایمر بچسبه و از DNA الگو رشته جدیدی بسازه
مراحل بعد در واکنش زنجیره ای پلیمراز در واقع تکرار تمام این مراحل از ابتدا تا انتها است به طوری که با تکرار به میزان 25 تا 40 چرخه، میزان DNA کپی شده به بیش از 130 میلیون مولکول DNA دو رشته ایی میشه.
مرحله طویل شدن نهایی (Final elongation): این مرحله، پس از آخرین سیکل PCR در دمای 72 درجه انجام می شه، تا اطمینان حاصل شه که همه تک رشته های DNA همانند سازی شدن.
نگهداری نهایی (Final hold) : در این مرحله، محلول نهایی به مدت کوتاهی در دمای ۴ الی ۱۵ درجه قابل نگهداری هست.
در نهایت می تونیم صحت انجام PCR را از طریق الکتروفورز در ژل آگارز یا پلی اکریل امید بررسی کنیم.
بازنشر : کلایمر
